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        理學類細胞組分分析方法

        2021-07-28 11:25:48

        一、細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法(組織化學和細胞化學法)

        細胞化學技術:組織化學和細胞化學法、免疫細胞化學法

        組織化學和細胞化學法的基本原理:利用--些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合的特征,通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量,從而得以對某種成分進行研究和分析。

        1.金屬沉淀法:利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉淀,借以辨認所檢查的物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后,產生無色的磷酸鉛,再與硫化胺反應最終生成CoS或PbS有色沉淀,而顯示出酶

        活性。(如酸性磷酸酶的顯示)

        2.Schiff反應:細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。這種反應通常用于顯示糖(PAS反應)和脫氧核糖核酸(Feulgen 反應)。

        Feulgen Staining:1924年由Feulgen和Rossenback二學者發明,對DNA的反應具有高度的專一性。

        原理: RNA被鹽酸水解,DNA中的嘌呤被解離,從而使五碳糖的一-端 出現醛基,而醛基能使Schiff試劑中的無色品紅反應,形成紫紅色的帶醌基的化合物。

        3.聯苯胺反應:過氧化酶分解H202。產生新生氧,后者再將無色的聯苯胺氧化成聯苯胺藍,進而變成棕色化合物。

        4.脂溶染色法:借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。

        5.茚三酮反應:顯示蛋白質。

        二、細胞內特異核酸的定位與定性

        分子雜交技術( molcular hybridization):是在研究DNA分子復性變化基礎上發展起來的一種技術。

        原理:具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段,在適當條件下,通過氫鍵結合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。

        1.原位雜交(In situ hybridization):根據DNA分子復性的原理,在不破壞細胞與細胞器的情況下,采用核苷酸探針檢測特定核苷酸序列在染色體的精確位置的技術,叫作原位雜交。

        2.電鏡水平的原位雜交技術:生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合。

        3.印跡雜交(blot hybridization):用已知的帶有標記的特定核酸分子(或抗體、蛋白質分子)作為探針,與通過印跡被轉移的核酸分子(或抗原、蛋白質分子)片段雜交的過程。

        4.Southern blotting (DNA印跡法):應用2P標記的DNA或RNA探針,與通過凝膠電泳分離并作了變形處理的DNA片段(已轉移到了硝酸纖維素濾膜上)進行雜交來顯示這些DNA。

        5.RNA印跡術(Northern blotting):應用放射性標記的DNA探針與RNA分子(通常轉移到了硝酸纖維素濾膜上)雜交來顯示這些RNA分子的過程。

        6.蛋白質印跡術( Western blotting):用來檢測在不均一蛋白樣品中是否存在目標蛋白的一種技術。蛋白質變性凝膠電泳分離轉移到濾膜上,通過專一抗體探測目標蛋白,然后用一種標記的“二抗”檢測在印記中存在的免疫復合物。


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